국문요약
피부조직 치환을 위한 EDC 가교화 콜라겐-히알루론산
기질에 관한 연구
연세대학교 대학원
생체재료학전공
박 시 내
화상이나 각종 피부 궤양 등 여러 가지 이유로 인한 인체 피부 결손과 그에 따른
단백질의 손실은 외부 미생물의 침입을 용이하게 하며 일련의 이런 과정들은 상처부위
에 대해 dressing이나 피부 대체물을 적용함으로써 억제될 수 있다. 인체 내에서 가장
풍부한 콜라겐은 특이한 구조와 기능적인 특징으로 인해 피부대체물의 재료로 많이 연
구되고 있다. 세포외기질의 중요한 성분중 하나인 히알루론산 또한 높은 수분함유량과
생체 내 분해성 때문에 생체재료로서 많이 사용되고 있다. 콜라겐과 히알루론산은 모두
세포외기질의 주요 성분들로서 조직의 형태를 유지하고 세포의 생장능을 보장하는 역할
을 담당한다. 생체조직의 손상부위에 이와 같은 세포외기질 성분을 제공한다면 그 조직
세포가 재생력을 같을 수 있게 되므로, 최근 콜라겐과 히알루론산을 인공 조직대체물의
기본적인 기질로 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 이러한 재료는 천연
고분자가 갖는 물리적 특성으로 인해 기계적 강도가 약하고 영구적인 복합체 형성이
어려워 인위적인 가교화가 필요한 실정이며 화학물질을 가교화물로서 이용하였을 경우
세포와 조직에 대한 독성 등이 문제점으로 제기되고 있다. 또한 콜라겐을 주원료로 하
는 생체재료들이 대부분 미생물 감염의 위험이 높고, 효소에 분해가 잘되는 등의 문제
로 인하여 응용에는 한계가 있다.
따라서 본 연구를 통해 적절한 기계적 특성과 미생물에 대한 오염 방지능이 있는
콜라겐/히알루론산 복합체를 개발하여 피부조직재생을 위한 생체재료로써 이용하고자
하였다. 이를 위해 본 연구는 네 부분으로 나뉘어 진행되었다. 첫 번째, 적절한 기계적
물성을 가진 다공성 구조의 콜라겐/히알루론산 복합 지지체를 화학적 가교화법을 이용
하여 제조하고 그 효용성과 세포독성을 평가하였다. 두 번째, 가교화된 콜라겐/히알루
론산 복합지지체 내의 히알루론산이 인체유래 진피섬유 아세포에 미치는 영향을 조사하
고 이를 토대로 최적 히알루론산의 함량을 결정하였다. 세 번째, 가교화된 콜라겐/히알
루론산 복합체에 각종 수용성 항생물질들을 함입시킨 후 물리적 강도를 측정하고 생체
외 방출실험, 생물학적 활성시험 및 세포독성 시험을 수행하였다. 네 번째, 다공성 콜라
겐/히알루론산 복합체 매트릭스와 콜라겐 경질막으로 이루어진 이중막을 제조하고 이
에 토브라마이신과 조직성장인자를 함유시켜 동물실험에 적용하여 창상치유에 대한 효
과를 알아보았다.
다공성구조의 콜라겐-히알루론산 매트릭스는 동결건조기법으로 제조되었고 기계적
강도를 증대시키기 위해서 1 mM에서 100 mM의 농도로 1-ethyl-3-(3-dimethyl
aminopropyl)carbodiimide (EDC)를 사용하여 가교화시켰다. 제조된 지지체의 가교화
전후 SEM 관찰 결과, 동결건조 온도에 따라 각각 40, 90, 230 ㎛의 pore와 58-66%의
porosity를 관찰 할 수 있었다. Swelling test (팽윤정도)와 IR로 각 조건에 따른 가
교화 정도를 측정했다. Swelling test 결과는 조건에 따라 별다른 차이를 보이지 않았
고, IR은 EDC 처리군의 경우 amide bond에서 강한 intensity를 보였다. 효소 분해
시험에서는 EDC 처리한 매트릭스가 콜라게네이즈 활성에 대해 0.625%
glutaraldehyde로 처리된 매트릭스에 비해 강한 저항성을 보였다. 또한 L929 섬유아세
포를 이용한 세포독성 시험에서, EDC 처리된 콜라겐-히알루론산 매트릭스가 세포에 대
해 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
여러 가지 히알루론산 농도와 결합된 EDC-가교화 다공성 콜라겐 매트릭스가 피부
조직 재생을 위한 지지체로 이용되었다. 여러 농도의 히알루론산이 포함된 매트릭스의
공극 크기는 시차주사현미경을 통해 150-250 ㎛임을 관찰했다. 히알루론산에 대한
retention test에서는 히알루론산의 농도가 초기의 급격한 감소 이후 24시간 이내에 천
천히 감소함을 보였다. 콜라겐 매트릭스 내에 가교화된 히알루론산의 세포에 대한 효과
를 알아보기 위해 히알루론산의 농도를 달리한 매트릭스 상에서 인체유래 진피 섬유아
세포를 배양하였다. 인체유래 진피 섬유세포는 대조군으로 사용된 폴리우레탄 매트릭스
보다 콜라겐-히알루론산 지지체 상에서 더욱 향상된 부착능을 나타내다. 세포의 증식속
도는 MTT test와 조직학적 관찰을 통해 측정하였으며 배양 2 주 후 9.6 % 이상의 히
알루론산이 함유된 콜라겐 매트릭스 상에서의 성장속도가 가장 빠른 것으로 나타났다.
세포 이주능 시험에서는 5.4 % 이상의 히알루론산이 함유된 콜라겐 매트릭스로의 세포
이주가 더욱 활발히 이루어 졌음을 알 수 있었다.
위 결과들을 바탕으로 콜라겐 매트릭스에 가교된 상태의 히알루론산이 섬유아세포
의 접착능, 증식증 및 이주능에 긍정적 영향을 미친다는 것을 확인하고 히알루론산이
9.6 % 함유된 콜라겐 매트릭스에 감염방지의 목적을 위해 토브라마이신, 폴리믹신비
및 시프로플록사신 등의 항생물질을 함입시켰다. 이들의 약물방출 시험을 실시한 결과
초기에 빠른 방출이후 지속적이고 느린 방출이 이루어짐을 알 수 있었다. 또한 항생효
과 실험에서는 시프로플록사신이 48 시간 동안 활성을 나타내는 등 가장 큰 활성을 나
타냈으나 0.4 mg/ml의 농도에서 섬유아세포에 대한 독성을 나타내었다. 토브라마이신
과 폴리믹신비의 경우, 각각 1.6 mg/ml 및 0.8 mg/ml 이하의 농도에서는 뚜렷한 세
포독성이 나타나지 않았으며 동량이 함입된 콜라겐/히알루론산 매트릭스를 함께 배양
한 실험에서도 동일한 결과가 나타났다.
진피 조직의 재생을 촉진하고 감염을 억제시킬 수 있는 인공 재생막의 개발을 위
해 콜라겐/히알루론산 복합체로 이루어진 이중 재생막을 제조 및 가교화하고 이에 토
브라마이신과 조직성장인자를 함입시키고 이를 기니아 픽 모델에서의 피부 창상조직에
적용하여 그 효과를 관찰하였다. 처치 7일 째에 창상수축율을 살펴본 결과 재생막을 처
치하지 않은 대조군에서 59.32±6.6 %에 비해 콜라젠 막 적용군은 62.81±3.4 %, 콜라
젠-히알루론산 막은 73.59±7.2 %, PDGF과 토브라마이신을 함유한 콜라젠-히알루론산
막 적용 군은 73.59±7.3 %, bFGF과 토브라마이신이 함유된 약물 함유막을 적용한 군
의 경우는 71.48±4.59 %로서 전체적으로 단독으로 약물만을 함유한 막보다는 성장인
자가 함께 들어있는 막을 적용한 군의 창상수축률이 높게 나왔으나 유의적인 차이를
보이지는 않았다. 피부생검의 조직학적 관찰을 수행한 결과 진피재생막 이식 후 3일째
염증이 심하였다가, 7일째 혈관형성이 활발해지고 염증은 약간 감소하며 표피가 가장자
리부터 자라나기 시작하였다. 14일째 섬유아세포의 뚜렷한 증식과 콜라젠 생성이 관찰
되었으며 진피의 혈관은 감소하기 시작하고 표피의 재생이 뚜렷했다. 항생제가 포함된
군과 포함되지 않은 군에 있어서 염증정도의 의미 있는 차이는 보이지 않았으며
control에 비해 재생막을 적용한 군이 진피 두께가 두꺼웠다. 콜라젠과 히알루론산이
포함된 재생막을 적용한 군이 다른 군에서 표피재생이 다른 군에 비해 빨리 시작되었
으며 초기부터 콜라젠 합성이 증가함을 관찰할 수 있었다.
따라서 이러한 연구 결과를 통하여 EDC에 의한 콜라겐-히알루론산의 가교화가 성
공적으로 이루어졌음을 확인하였고 이를 이용하여 개발된 항생제 및 조직성장인자 함유
다공성 콜라겐-히알루론산 매트릭스가 피부조직 손상부위의 감염 방지 및 효과적인 조
직 재생을 위한 피부조직 대체물로서 응용될 수 있음을 제시하였다.
